我院徐素宏课题组和浙大生研院马为锐课题组合作研发单分子RNA成像新技术MASS在eLife发表
近日浙江大学爱丁堡大学联合学院（ZJE）徐素宏课题组和浙江大学生研院马为锐课题组合作在eLife杂志上发表题为Enhanced Single RNA Imaging Reveals Dynamic Gene Expression in Live Animals的研究论文。本研究开发了一种信号放大增强型单分子mRNA成像新技术，并利用该技术揭示了线虫表皮特异基因快速感应细胞膜损伤启动mRNA实时转录的时空动态过程。 生物体快速感应损伤并启动修复的能力对于生存至关重要，这是生物体保护自身的基础。2021年两位科学家因发现温度和触觉感受器获得诺贝尔生理学或医学奖，然而人类对于外界的感知并不仅限于此。生物体无时无刻不面临着损伤的危险，皮肤损伤启动修复是一个高度动态的过程，但是皮肤对于外界的损伤的感应是如何产生的还不清楚。之前徐素宏课题组发现钙信号和线粒体活性氧等不依赖转录的快速感应损伤新模式。近日徐素宏课题组联合马为锐课题组的研发mRNA单分子成像新技术实时观察转录依赖的损伤快速感应损伤过程。 过去MS2-MCP系统被视为活体单分子RNA成像技术中的金标准，并得到广泛使用。MS2系统成像基于MCP蛋白与MS2序列的发夹结构的紧密结合通过将多个重复的MS2序列插入到目标RNA中，即可招募多个与MCP融合的荧光蛋白，实现单个RNA分子的可视化。MS2系统对内源性mRNA成像需要将24个串联重复的MS2序列（1300nt）敲入基因组特定位置。由于24xMS2长度长，且为重复序列，定点敲入基因组效率低。为了减少MS2重复数量同时实现更高的RNA成像质量，该研究将MS2与Suntag蛋白质信号放大系统相结合，开发了标记单分子RNA的新技术，命名为MASS（MS2-based signal Amplification with Suntag System）。MASS对单分子mRNA的成像原理基于插入mRNA 3′UTR中的8xMS2重复序列、融合有串联Suntag的MCP蛋白和识别Suntag的scFV-sfGFP的信号级联放大。该系统实现了高时间分辨率的活细胞及活体动物内源RNA成像。与经典的24xMS2系统相比，该研究使用了8xMS2，提高了基因组序列靶向插入的效率；同时Suntag招募了更多的荧光蛋白分子，显著放大了单分子RNA的标记信号。 本研究利用线虫模型验证了MASS在活体动物中具有标记mRNA并实时观察其动态转录和运动的能力。通过已有的单线虫损伤RNA-seq数据以及qPCR验证，筛选出两个表皮损伤后表达快速上调的基因：C42D4.3和mai-1。本研究构建了C42D4.3与mai-1 的3′UTR区域8xMS2敲入线虫，同时通过组织特异性启动子col-19将MCP-24xSuntag和scFv-sfGFP元件在8xMS2敲入线虫的表皮细胞表达。损伤前野生型（WT）线虫和C42D4.3-8xMS2敲入线虫中几乎没有GFP亮斑；通过激光或针刺损伤线虫表皮，MASS标记的内源C42D4.3和mai-1的mRNA迅速表达，形成大量的点状GFP信号,说明MASS能检测内源mRNA的表达。此外GFP亮斑在损伤后1分钟即出现在损伤区域周围，说明激光损伤能快速激活内源C42D4.3 mRNA表达。随后，GFP亮斑的产生逐渐从损伤区域附近向远端扩展，提示损伤产生的效应因子逐渐扩散并激活基因表达。上述研究表明MASS可用来追踪活体动物中RNA的动态过程以及为动物模型研究RNA转录、迁移等诸多其他科学问题提供了有力的技术支持，也为动物水平内源性单分子mRNA感应损伤的时序动态研究带来突破。 浙江大学马为锐实验室博士研究生胡雨岑，浙江大学爱丁堡大学联合学院(ZJE)徐素宏课题组博士后许静秀和双博士研究生高尔罄为本文共同第一作者，马为锐和徐素宏为共同通讯作者。参加该研究的还有马为锐课题组博士研究生范学渊、叶柄成和博士后魏杰丽。该工作受国家重点研发计划、国家自然科学基金委、浙江省自然科学基金、生研院启动基金、杭州市创新团队、浙大青年科研创新专项的资助。全文链接： https://elifesciences.org/articles/82178课题组介绍About lab徐素宏实验室的研究方向主要是聚焦细胞和组织的损伤应激，伤口修复及再生的分子动态调控机制，细胞器感知应激损伤的内源性快速动态变化机理等。团队希望有更多热爱基础科学研究、对细胞生物学、生物信息学、组学和组织损伤修复和与再生感兴趣的学生、博士后加入。课题组网页：https://person.zju.edu.cn/suhongxu许静秀博士毕业于浙江大学医学院，导师为徐素宏教授，其研究领域为细胞膜损伤感应和损伤修复，博士后阶段继续探究内源性修复蛋白感知细胞膜损伤的分子机制。
2023-03-10
